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La clonación y caracterización de un asociado-Kruppel Novel Caja Familia represor transcripcional que interacciona con el retinoblastoma producto génico, RB * Abstracto El producto del gen del retinoblastoma, RB, parece funcionar como un supresor de tumor clave por la represión de la expresión de genes activados por miembros de la familia E2F de factores de transcripción. Con el fin de lograr esto, RB se ha propuesto para interactuar con un represor transcripcional. Sin embargo, no hay auténticos represores transcripcionales han sido identificados en virtud de la interacción con RB. Al utilizar el sistema de levadura de dos híbridos, hemos identificado un nuevo miembro de una familia conocida de represores transcripcionales que contienen dedos de zinc del tipo Kruppel y un motivo represor transcripcional portátil conocido como la caja asociada a Kruppel (KRAB). El ratón y las formas humanas de la nueva proteína KRAB RB-asociado (RBak) se expresan ampliamente. El motivo de aminoácidos que une los dedos de dominio KRAB y zinc parece ser necesario para la interacción con RB in vitro. RBak humano ectópica expresado en fibroblastos es una proteína de 80 kDa que se localiza en el núcleo. La expresión de cualquiera de RB o RBak en 10T1 / 2 de fibroblastos reprime la activación de un promotor E2F-dependiente y disminuye la síntesis de ADN en un grado similar. Sin embargo, una forma mutante de RBak que no puede interactuar con RB in vitro no es capaz de prevenir la síntesis de ADN. Se presenta un modelo en el que RB interacciona físicamente con la novela represor transcripcional RBak para reprimir genes E2F-dependientes e impedir la síntesis de ADN. Durante la última década, muchos estudios de los genes de susceptibilidad al cáncer han dado una nueva visión de la patogénesis tanto de malignidad y la biología normal de los procesos celulares y de desarrollo. El gen de retinoblastoma, RB. proporciona un ejemplo elegante. El gen RB fue descubierto inicialmente por las estrategias de clonación posicional y ha demostrado ser mutado en pacientes con retinoblastoma hereditario; por lo tanto, RB fue el primer gen de buena fe supresor de tumores (revisado en Refs. 1 y 2). Mucho trabajo posterior se ha centrado en el mecanismo molecular por el cual su producto génico, RB, controla los aspectos clave de la proliferación celular y el mecanismo por el que se regula esta función. Los estudios iniciales indicaron que una función normal de RB 1 es para detener la proliferación celular mediante la prevención de la entrada de las células en la fase S del ciclo celular. Cuando la proteína RB se entrega a las células mediante microinyección de la proteína o la transfección de cDNA, que suprime el fenotipo maligno (3) y bloquea la entrada de las células en la fase S (4-7). La capacidad de RB para prevenir el crecimiento de células depende de sus dominios funcionales, denominados los motivos A y B, y en su extremo carboxilo terminal (5). Los motivos A y B están unidos y, presumiblemente, inactivados por varias oncoproteínas virales tales como antígeno simian virus 40 T grande y adenovirus E1a oncogénica (8-12). Estos motivos son también los sitios de muchas mutaciones causantes de cáncer nativas en el gen RB (11. 12). Juntos, el extremo carboxilo y los motivos A y B de RB se han demostrado que se unen a un número de proteínas celulares, así como a las oncoproteínas virales mencionadas anteriormente (1). RB se piensa llevar a cabo sus diversas funciones celulares, incluyendo su actividad supresora de tumores, mediante la interacción con estas proteínas celulares. Tal vez el principal de la lista cada vez mayor de proteínas conocidas para interactuar con RB es E2F-1 (13-17). E2F-1 fue el primer miembro identificado de una familia de activadores de la transcripción (colectivamente conocidos como E2Fs) que incluye al menos seis E2Fs y dos socios de unión al ADN heterodiméricas, DP-1 y -2 (revisado en Refs. 18 a 20). E2F-1 se une a elementos de ADN que median dependiente del ciclo de inducción de células de un número de productos génicos como células iniciar la síntesis de ADN, tales como la dihidrofolato reductasa (21), b-Myb (22. 23), c-Myc (24), y la propia E2F-1 (14. 25. 26). La importancia de la RB de unión a E2F-1 fue sugerido por las siguientes conclusiones: 1 mutaciones) que ocurren naturalmente en la A y B motivos de interacción RB Prevenir RB-E2F (27-29); 2) la interacción física de RB con E2F-1 se correlaciona con la represión de la transcripción de genes que se cree que ser activado por "libre" E2F-1 (24. 30. 31); y 3) la expresión ectópica de E2F-1 puede conducir a células en fase S (32-34) y superar la detención del crecimiento inducida por RB (29. 35). Juntos, estos resultados todos apoyan un modelo en el que las funciones de RB como un supresor de tumores mediante la interacción física con E2Fs para reprimir la expresión de genes E2F-dependiente. Dos cuestiones generales se pueden plantear en relación con posibles mecanismos por los cuales RB puede reprimir la transcripción. En primer lugar, no está claro si RB tiene una capacidad intrínseca para reprimir la expresión de genes o si RB logra esta represión mediante la asociación con proteínas adicionales, tales como un represor transcripcional. En segundo lugar, no se sabe si RB afecta directamente a la función del aparato transcripcional o secundariamente regula la maquinaria transcripcional mediante la regulación de la estructura de la cromatina. Con respecto a la cuestión anterior, la actividad del represor RB intrínseca parece paradójico a la capacidad documentada de RB para mejorar la actividad de otros factores de transcripción. Por ejemplo, la función de transactivación de MyoD (27. 36. 37), C / EBP (38), NF-IL6 (39), GAL4-Myc (40), y ATF-2 (41) se puede mejorar mediante la interacción directa con RB. Con respecto a esta última cuestión, a pesar de los recientes hallazgos sugieren que la RB puede afectar a la estructura de la cromatina mediante la regulación de la actividad de la histona deacetilasa, esto no puede explicar cuantitativamente para todos represión RB-mediada y podrá aplicarse únicamente a un subconjunto específico de genes que pueden ser reprimidos por RB (42. 43). Por lo tanto, aunque puede haber múltiples mecanismos de represión transcripcional mediada por RB, favorecemos un modelo en el que RB puede reprimir genes E2F-dependientes mediante la formación de un complejo multimérico con E2F-1 y un represor transcripcional putativo. Tal modelo se ha propuesto anteriormente (44), y un represor transcripcional, HBP1, se ha demostrado que interactúan con RB y las p130 proteína Rb-como (45). Sin embargo, no se ha establecido la importancia funcional de HBP1 con respecto a la función RB para detener la proliferación celular. Debido a que RB es esencial para el desarrollo del sistema nervioso murino (revisado en Ref. 46), hemos tratado de identificar proteínas que interaccionan con RB que se expresan en el cerebro de embriones de ratón. Como parte de este esfuerzo, hemos identificado un nuevo miembro de una familia conocida de represores transcripcionales. Esta familia de genes contiene dedos de zinc del tipo Kruppel (47. 48) y un motivo represor transcripcional portátil conocido como la caja asociada a Kruppel (KRAB) (49). Nuestros estudios indican que esta RB - una proteína (RBak) ssociated K RAB puede interactuar físicamente con RB y puede contribuir a RB dependiente de supresión de la activación transcripcional mediada por E2F y la detención del ciclo celular mediada por RB. PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES Plásmidos y estrategias de subclonación Los plásmidos utilizados en la pantalla de la levadura de dos híbridos incluyen pAS1-RB (p56) (aminoácidos 295-928 de RB ratón), pAS1-RBΔA (deleción de los aminoácidos 434-476), y pAS1-RBΔB (deleción de los aminoácidos 697 -763). Todos estos fueron creados por subclonación las secuencias descritas en el plásmido pAS1 (50). Hemos clonado pACT-mM17.1, que contenía un inserto de ADNc de 1,4 kb, a partir de una biblioteca de ADNc usando λACT la levadura de dos híbridos pantalla como se describe (50) (ver a continuación). Hemos creado pBS-hM17.6 subclonando un inserto de ADNc de 5,1 kb a partir de una célula HeLa biblioteca lambda ZAP cDNA (Clontech) en el plásmido pBluescript II (Stratagene). Los plásmidos de expresión para RB incluyen pCMV-RB (en peso) (B / X-HA) que contenía el ADNc que codifica de tipo salvaje RB ratón (proporcionado por P. Hamel, B. Sellers, y B. Kaelin) (51) y pCMV RB (LP), que codifica los aminoácidos 379 a 928 de RB humano (5) (proporcionado por E. Knudsen), ambos de los cuales tenía ADNc respectivos subclonados en el plásmido pCMVneobam. plásmidos reportero para transfecciones transitorias incluyen el gen de la β-galactosidasa dirigido por el promotor CMV (pCMV-nβGal) (52), y la acetiltransferasa cloranfenicol (CAT) de genes impulsado ya sea por el citomegalovirus (CMV) (pCMV-CAT) (51) o por dos reiterado de tipo salvaje o mutado sitios adyacentes al promotor de timidina quinasa E2F vinculante (pE2F [en peso] y CAT CAT pE2F [mut], respectivamente) (32) (proporcionado por WH Lee). Los plásmidos de expresión que codifican RBak humana se generaron como sigue: pCMV-hRBaK se generó por tres piezas ligación del fragmento Nru I - Hin dIII de pBShM17.6 (pb 395 a 1714; Fig 1 A.); el fragmento Hin dIII - Xba I de pCMV-MT6hRBaK (véase más adelante), que incluye la secuencia de arranque en el pb 1714 y continuando hasta aproximadamente 80 pares de bases 3 'al codón de parada (Fig 1 A.); y el fragmento Stu I-Xba I de pCS2 + plásmido, que contiene el promotor CMV (proporcionado por D. Spicer) (53). Hemos generado pCMV-MT6hRBaK en varios pasos. En primer lugar, pCMV-MT6hRBaK-LZ se hizo mediante el uso de cebadores de PCR con los sitios que flanquean Xba I para amplificar ADNc correspondiente a los dedos de zinc de enlazador y hRBaK (pb 756-2744, Fig. 1 A). Este inserto se subclonó en el sitio Xba I de pCS2 + MT6 (proporcionado por D. Spicer), que contiene el promotor CMV y seis marcadores de epítopo Myc (53). A continuación, se usó PCR para amplificar cDNA correspondiente a la secuencia de codificación hRBaK comenzando con el segundo aminoácido (punto de ebullición 523) mediante el uso de 5 'y 3' cebadores a partir de las pb 523 y 1749, respectivamente (Figura 1 A). Eco RI y Hin dIII sitios se añadieron a la 5 'y 3' cebadores, respectivamente. Finalmente, pCMV-MT6hRBaK se generó por tres piezas de la ligadura de la Eco RI - Hin dIII digesto de este fragmento de PCR, el Hin dIII - Bgl II digerir fragmento de pCMV-MT6hRBaK-LZ (que corresponde a la secuencia de codificación hRBaK restante), y la Eco RI - Bgl II digerir fragmento de pCMV-MT6hRBaK-LZ (que corresponde al plásmido vehículo y etiquetas de epítopo Myc). Por lo tanto, el plásmido resultante contenía el marco de lectura hRBaK fusionado en marco con seis marcadores de epítopo Myc en el extremo amino. Hemos generado pCMV-MT6hRBaK-KΔL mediante el uso de PCR para amplificar la secuencia codificante de hRBaK desde el pb 523 hasta 1.032, que corresponde a la secuencia de la proteína desde el segundo aminoácido a través de la primera media del motivo enlazador (Fig. 1 A). El cebador 5 'codifica una señal artificial nuclear de localización (MAPKKKRKV) adyacente a la secuencia RBak-específico. sitios Eco RI y Xba I se añadieron a los extremos 5 'y 3' de los cebadores, respectivamente. Este producto de PCR amplificado se subclonó, en cuadro, a los sitios Eco RI - Xba I en pCS2-MT6. codifican proteínas relacionadas con humanos y de ADNc de ratón RBak los dedos de zinc que contienen motivos KRAB y Kruppel tipo. A, ADNc parcial y la secuencia de aminoácidos predicha para RBak humano. La primera secuencia ATG (pb 519), KRAB A y B motivos (pb 537-756), enlaces GEKPY entre Cys 2 y sus 2 dedos de zinc y el codón de parada están subrayados. Tenga en cuenta que el enlace entre el 8 y 9 de Cys 2 y el dedo de zinc 2 es degenerado (subrayado doble). B, la alineación de la secuencia de aminoácidos predicha para el ratón y RBak humano. Los nucleótidos en la secuencia humana que son idénticos en el ratón se indican con un punto. KRAB motivos A y B están a la sombra. Cisteína e histidina residuos que definen los dedos de zinc son reiterados en negrita. Sus GEKPY 2 y Cys 2 enlaces están subrayados. Tenga en cuenta que el enlace GEKPY entre el octavo y dedos de zinc 9º es degenerado tanto en ratón y proteínas humanas y que no hay una secuencia GEKPY tanto en proteína de ratón y humano que no está flanqueada por los dedos de zinc (doble subrayado). C, diagrama esquemático de RBak mostrando KRAB, enlazador, y dedos de zinc (ZF) y el porcentaje de identidad de aminoácidos entre el ratón y RBak humano. La levadura de dos híbridos pantalla La levadura de dos híbridos pantalla para aislar proteínas RB-interactuar cDNA de codificación se realizó esencialmente como se describe anteriormente (50). Utilizamos pAS1-RB (p56), que abarca los aminoácidos 295-928 de RB ratón, como el "cebo" para seleccionar una biblioteca de ADNc de fago 1,5 × 10 6 λ. Esta biblioteca de ADNc λACT, como uno descrito anteriormente (50), se ha generado a partir de ARN aislado de las cabezas de embriones E13.5 ratón y el cerebro de ratones recién nacidos (proporcionados por E. Olson). Los ADNc resultantes se fusionan con el dominio de activación de GAL4 y conducido por la alcohol deshidrogenasa (ADH), el promotor (50). Los plásmidos de colonias β-galactosidasa-positiva que se formaron en presencia de pAS1-RB (p56) pero no en la presencia de formas mutadas de RB se analizaron adicionalmente. La clonación de ratones y humanos RBak formas más largas de ratón y ADNc RBak humano se buscaron mediante el cribado de otras bibliotecas de ADNc como sigue. Una sonda de ADNc se realizó mediante el uso de PCR para amplificar un fragmento de 388 pb de pACT-mM17.1 que corresponde a los aminoácidos 126 a 255 de ratón RBak (5 (Fig 1 B.) Cebador, 5'-tcatttcccccagctcaggt; 3 ' cebador, 5'-cagttccatttgtgatctcggat). Este producto de PCR se purificó en gel, marcado con [32 P] dCTP usando el kit de cebador aleatorio etiquetado PRIMIT II (Stratagene), y se utiliza como sonda para cribar bibliotecas de ADNc que contienen 1 × 10 6 fago de embrión E11.5 ratón y células HeLa (Clontech). Los insertos de Eco RI de los clones seleccionados se subclonaron en el plásmido pBSII KS. Dos plásmidos aislados a partir de la biblioteca de embrión de ratón tenían secuencias de ADN que se solapan de la pieza de inserción (mM17.1) en pACT-mM17.1 (mM17.3, mM17.16) y se utilizaron para generar una secuencia de consenso que codifica mRBaK. Un plásmido aislado a partir de la biblioteca de células HeLa contenía un inserto de 5,1 kb que codifica hRBaK. Análisis de la secuencia Los ADNc que representan ratón y RBak humano se secuenciaron completamente en ambas direcciones utilizando Sequenase según las instrucciones del fabricante (Amersham Pharmacia Biotech). La superposición de mapas contig y predichos traducciones de aminoácidos se generaron mediante el uso de software de DNAstar (DNAstar, Inc.). Secuencias de ratón y humanos RBak serán depositados en la base de datos GenBank TM. transferencia Northern El MTN múltiple blot de ARN de tejido humano humano (Clontech) se hibridó con una sonda de ADNc generado por digestión de pBShRBaK con Acc I y Avr II. El producto 418 pb, que se extendía desde el pb 58 a 476 (Fig. 1 A), se purificó en gel, marcado con [32 P] dCTP como se describió anteriormente, y se hibridó a la transferencia de ARN usando protocolos establecidos (54). Interacción entre RBak y GST-RB Las interacciones de GST-RB y RBak se caracterizaron in vitro. Para generar humana de longitud completa RBak, pBS-hM17.6 se transcribe y se traduce mediante el uso de ARN polimerasa de T7, [35 S] metionina, y el protocolo de transcripción-traducción de reticulocitos acoplado a TNT (Promega) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Para generar ratón de longitud parcial y las proteínas RBak humanos, se utilizó PCR para amplificar las regiones de pACT-mM17.1 o pBS-hM17.6 que codifican el motivo KRAB y el enlazador (KL), el motivo KRAB y parte del enlazador ( KΔL), y el motivo enlazador y varios dedos de zinc (LZ). El cebador 5 'para el ratón RBak-KL y - KΔL fue 5'-tcattcaaggatgtggctgtgg. Los cebadores 3 'fueron 5'-ttcgaagggcttcagttccattt y 5'-gctttcccacactcaaaacacat para el ratón RBak-KL y - KΔL, respectivamente. El cebador 5 'para el ser humano RBak-KL y - KΔL fue 5'-tcattcaaagatgtggctgtgga. Los cebadores 3 'fueron 5'-caaagggcttcatttccatttgtg y 5'-gttttcccacattcattacactca para el consumo humano RBak-KL y - KΔL, respectivamente. Las proteínas codificadas por estos productos de PCR incluyen aminoácidos 9-259 y 9-169 para ratón RBak-KL y - KΔL, respectivamente, y los aminoácidos 9-261 y 9-170 para humano RBak-KL y - KΔL, respectivamente. Para generar hRBaK-LZ, que codifica una proteína de los aminoácidos 80 a 364, se utilizó el 5 'y 3' cebadores 5 'y 5'-gaagcctggagagttgatgacc tggtgcagggtgagatgtgtc, respectivamente. El 5 'cebadores para todas estas reacciones de PCR contenían los polimerasa y traducción señales de iniciación de ARN T7 5' gctaaatacgactcactataggaacagaccaccATG-3 'unidas a las secuencias RBak-específicos. Para el ensayo de pull-down GST, cantidades equivalentes de proteínas traducidas in vitro se incubaron con GST o GST-RB (p56) unido a perlas de glutatión-Sepharose equilibrada en tampón EBC (50 mM de Tris, pH 7,5, 120 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0,5% Nonidet P-40) con 4% de albúmina de suero bovino y 1 mm fluoruro de fenilmetilsulfonilo, durante 90 min a 4 ° C. Las perlas de glutatión se lavaron después 4 veces con tampón de EBC, y las proteínas unidas se solubilizaron en tampón de carga de SDS-gel, se fraccionaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, y se visualizaron por fluorografía. Transfección transitoria y ensayo de CAT Para analizar si hRBaK contenía actividad represor transcripcional, 10T1 / 2 de fibroblastos se transfectaron mediante el uso de 2,75 g de plásmido con LipofectAMINE (Life Technologies, Inc.). Nos co-transfectadas pCMV-MT6hRBaK o pCMV-RB (LP) con el CMV-beta Gal plásmido reportero y con pE2F - CAT (en peso) - CAT, pE2F (mut), o pCMV-CAT. En el día siguiente, las células se alimentaron con suero bovino fetal al 10% en medio de Eagle modificado por Dulbecco. extractos de células enteras se obtuvieron 24 h más tarde y se usan para determinar la actividad de CAT como se ha descrito previamente (51) y para determinar la actividad β-galactosidasa mediante el uso de Galacto-Light Plus (Tropix). la actividad de CAT a partir de varios experimentos representativos, cada uno con duplicados de las muestras, se normalizó al nivel de β-galactosidasa y se expresó como el incremento de veces sobre la actividad de las células transfectadas con plásmido reportero no. Expresión de proteínas y ensayos de proliferación celular Para analizar el tamaño y la localización subcelular de hRBaK expresó ectópica, transfectadas pCMV-RBak, pCMV-MT6hRBaK, o pCMV-MT6hRBaK-KΔL en 10T1 / 2 de fibroblastos mediante el uso de LipofectAMINE (Life Technologies, Inc.). Las células se mantuvieron en medio de crecimiento durante 48 h después de la transfección y luego se recogieron en tampón de lisis Nonidet P-40 como se ha descrito previamente (52) o fijadas por el uso de 2% de paraformaldehído. ectópica expresó RBak humano y humano Myc-RBak se detectaron mediante el uso de cualquiera de ratón anti-RBak antisuero con alcalina anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa (Jackson ImmunoResearch) y el desarrollo nitro azul de tetrazolio / 5-bromo-4-cloro-3-indolil color de fosfato o anticuerpo de ratón 9E10 anti-Myc con rábano picante anticuerpo conjugado con peroxidasa secundario (Jackson ImmunoResearch) y un aumento de quimioluminiscencia. Para la tinción de inmunofluorescencia, se detectaron proteínas etiquetadas-Myc en células paraformaldehído fijo que utilizan anticuerpos anti-Myc 9E10 ratón y rodamina o anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína (Jackson ImmunoResearch), esencialmente como se describe anteriormente (36). Para analizar si la expresión de RBak afectada la síntesis de ADN, 10T1 / 2 de fibroblastos fueron transfectadas transitoriamente como se describe anteriormente. En estos experimentos, las células fueron co-transfectadas con pCMV-MT6RBaK, pCMV-MT6RBaK-KΔL, pCMV-RB (en peso), o los respectivos plásmidos de expresión y con pCMV-beta Gal en una proporción de 4: 1 para marcar las células transfectadas. En el día después de la transfección, se tripsinizaron las células y se volvieron a sembrar en cubreobjetos de vidrio. Un día después, el medio se reemplazó con suero bovino fetal al 10% en medio de Eagle modificado de Dulbecco que contenía 10 μ m bromodesoxiuridina (BrdU). Después de 18 h, las células fueron fijadas a cubreobjetos con 2% de paraformaldehído y se analizaron por tinción de inmunofluorescencia con conejo anti-β-galactosidasa antisuero (Cappel), anticuerpo-BrdUrd anti-ratón (Becton Dickinson), el anticuerpo anti-conejo con fluoresceína acoplada, y rodamina anticuerpo anti-ratón - junto (Jackson ImmunoResearch) esencialmente como se describe anteriormente (36). se contaron las células ß-galactosidasa-positivas que eran BrdUrd-positivas y BrdUrd-negativo para determinar los efectos sobre la síntesis de ADN. Antihumano RBak antisueros Para generar ratón anti-humano antisuero RBak, se subclonó un fragmento de ADNc generado por PCR que codifica la región de unión de hRBaK (aminoácidos 80 a 267, Fig. 1 B) en el plásmido de expresión bacteriana pGEX2T. se indujo la expresión de la proteína de fusión GST-enlazador hRBaK recombinante en células BL21. El producto se purificó mediante el uso de perlas de glutatión-Sepharose y se utilizó para inmunizar ratones BALB / c de acuerdo con protocolos estándar (55). Después de varias inmunizaciones, se obtuvo suero de los ratones para su uso en la transferencia Western. RESULTADOS Ratón RBak codifica una proteína RB-interactuando Una proteína de fusión que contiene el dominio de unión de ADN GAL4 y RBp56 fue utilizado como cebo en la levadura de dos híbridos pantalla de una biblioteca de cDNA de ratón (50). RBp56 incluye los motivos A y B, así como el extremo carboxilo terminal, que media interacciones entre RB y un número de proteínas celulares (revisado en Refs. 1 y 2), y es suficiente para bloquear la proliferación celular (4. 5). Aproximadamente 30 clones, incluyendo pacto mM17.1, siendo positivos después de la detección primaria y secundaria. Debido a que muchas proteínas se sabe que tienen interacciones biológicamente significativas con los motivos A y B de RB, se investigó si pacto m17.1 requiere estos motivos para interactuar con pAS1-RB (p56) en este ensayo. La pérdida de cualquiera de los A o B motivo impidió el crecimiento de la levadura transformada con pACT-M17.1, pero la pérdida de la terminal carboxilo no lo hizo (datos no mostrados). enzima de restricción y análisis de la secuencia de pACT-M17.1 indicó que contenía un ADNc de 1,4 kb que se predijo para codificar una nueva proteína con dedos de zinc de tipo Kruppel y un motivo represor KRAB. dedos de zinc de tipo Kruppel (56) se repiten en tándem de motivos que contienen dos residuos de cisteína y dos residuos de histidina (His Cys 2 2). Estos dedos de zinc son típicamente separados por la secuencia conservada de aminoácidos X GEKPY X (denominación del ácido amino carta individual) (47. 48). Se cree que aproximadamente un tercio de los varios cientos de genes estimados de ratón o humanos que contienen estos dedos de zinc de tipo Kruppel de contener también un motivo KRAB (49. 57), que alberga la actividad de represión transcripcional potente (58-61). No proteína KRAB previamente se ha demostrado que interactúan con las proteínas RB o RB-como. Por lo tanto, se optó por el término RBak de esta novela de ADNc, que al parecer codifica un RB - una proteína K RAB ssociated, y hemos realizado más estudios para comenzar a caracterizar su función. Análisis de secuencias de ratón y humano RBak Debido pacto mM17.1 parecía contener un ADNc parcial, que exhibió embrión de ratón (E11.5) y las bibliotecas de cDNA humanos de células HeLa para formas más largas. Se utilizó el producto de PCR de 388 pb que codifica los "enlazador" motivo (aminoácidos 126-255) entre el dominio KRAB y dedos de zinc para aislar la superposición de dos clones de cDNA de ratón adicionales y un clon de ADNc humano. El análisis de secuencia del clon de ADNc humano más largo (hM17.6) indicó que contiene un marco de lectura abierto 2142 pb (Figura 1 A). La secuencia de codificación propuesto es precedida por 518 pb de la secuencia no traducida al parecer antes de la primera ATG, que se ajusta más o menos a una secuencia de consenso Kozak (A en posición -3, A en la posición 4) (62) y está precedido por una trama en el codón de parada 188 pb 5 'del codón ATG (Fig. 1 A). El inicio de la traducción putativo y el codón en marco se observaron codón de parada en un clon de ADNc humano adicional que se aisló posteriormente utilizando hRBaK ADNc como una sonda (datos no mostrados). La secuencia de 2448 pb 3 'al codón de parada contiene una señal de poliadenilación y una cola poli (A). Una búsqueda de bases de datos de ADN publicadas para las secuencias similares a RBak ratón y humano demostrado que tenían diversos grados de similitud con numerosas proteínas previamente identificadas que contienen motivos KRAB y dedos de zinc de tipo Kruppel pero ninguna coincidencia idéntica. Por lo tanto, humanos y de ratón RBak parecen ser nuevos miembros de la familia dedo KRAB / zinc. secuencias de aminoácidos predicha de ratón y humano RBak indicaron que contienen KRAB A y B motivos (49) en sus extremos amino. A pesar de que muchas proteínas tienen KRAB tanto de estos motivos, la mayor parte de la actividad represor transcripcional de estas proteínas parece residir en la Un adorno (58-61. 63). En el extremo carboxilo de la proteína RBak predicho, hay 15 (ratón) y 16 (humanos) repetidas en tándem dedos de zinc de tipo Kruppel (Fig. 1 B). En RBak ratón y humana, la secuencia GEKPY después de que el dedo de zinc 8 y el componente H2 del dedo de zinc 10º son degenerados. En el ratón RBak, se encontró una aparente codón de parada para interrumpir lo que sería el 16 de dedo de zinc (Figura 1 B). Tal una parada brusca es inusual entre los miembros de la familia KRAB (60. 64. 65), lo que sugiere que este codón de parada puede no representar el verdadero extremo 3 'de la secuencia codificante para el ratón RBak. Tanto en ratón y RBak humano, un motivo de enlazador de aproximadamente 180 aminoácidos separa el dominio KRAB y los dedos de zinc (Fig. 1, A y B). Curiosamente, ambos también contienen una secuencia de ácido amino GEKPY individual, que no está flanqueada por los dedos de zinc, en el enlazador 29 residuos amino-terminal a la primera dedo de zinc (Fig.1 B). Aunque la secuencia de ADN dentro de esta región de engarce se piensa para definir subfamilias de proteínas que contienen KRAB-(65. 66), la secuencia de ADN del ratón y el enlazador RBak humana no era similar a la de otros genes de la familia KRAB publicados. RBak ratón general y RBak humano son 78% idénticas a nivel de aminoácidos. Hay 84 y 90% de identidad en los motivos KRAB y dedos de zinc, respectivamente, y la identidad de 54% en la región de enlazador (Fig. 1, B y C). Curiosamente, en el ratón y motivos de engarce RBak humanos, hay más de identidad en la región carboxilo-terminal, que hemos demostrado que se requiere para la interacción RB in vitro (véase más adelante), que en el motivo enlazador amino-terminal. En resumen, sobre la base de ADN y la secuencia predicha de aminoácidos, ratón y humano RBak parecen ser nueva, potencialmente miembros ortólogos de la familia KRAB de represores transcripcionales. Ratón y humano RBak Ampliamente se expresan en tejidos embrionarias y adultas Debido RBak fue clonado a partir de una biblioteca de cDNA enriquecida neurona, quisimos determinar su patrón de expresión mediante transferencia de Northern. Tenemos previsto que esto podría dar una idea de si RBak podría tener efectos específicos del tipo de células. Debido a que la familia de genes KRAB es grande, se utilizó una sonda de ADNc de la región 5 'no traducida de la RBak ADNc humano para la hibridación con una transferencia de Northern comercialmente disponible que contiene ARN a partir de una variedad de tejidos humanos. Esta sonda detectó un transcrito de aproximadamente 5,5 kb en todos los tejidos examinados (Fig.2). Similar amplia expresión de RBak se encontró en tejidos de ratón por hibridación del ratón RBak con transferencias de Northern que contienen ARNm de ratón (datos no mostrados). Aunque el tamaño de la transcripción RBak humano corresponde aproximadamente a la longitud del ADNc clonado, no está claro si el cDNA clonado incluye la región 5 'no traducida completa. No hemos podido extender este ADNc a los 5 'mediante el uso de la amplificación rápida de extremos de ADNc tecnología. Sin embargo, este enfoque puede haber sido complicada por la naturaleza rica en GC del extremo 5 'del ADNc. Cuando transferencias Northern se hibridaron con una sonda que codifica la región de unión de hRBaK, una transcripción ~5.5-kb y un transcrito más grande (~ 7 kb) se detectaron (datos no mostrados). La transcripción más grande puede representar tanto un producto de gen relacionado o diferentes de empalme de la transcripción hRBaK, un suceso que se ha descrito para otros miembros de esta familia de genes (61. 67-70). La amplia expresión de RBak humanos y de ratón sugiere que no puede tener funciones específicas del tipo de células y que puede contribuir a los efectos generales de RB en la detención del crecimiento celular en lugar de a los efectos de linaje dependiente de RB en la diferenciación celular. RBak humano se expresa ampliamente en los tejidos adultos. Autorradiografía de una transferencia Northern comercialmente disponible que contiene ARN a partir de una variedad de tejidos humanos después de la hibridación con un [α - 32 P] sonda de ADNc marcada con dCTP de la región 5 'no traducida de RBak humano. Este autorradiografía se desarrolló después de la exposición durante 24 h. Posteriormente, el blot fue despojado y se sondeó con una sonda de ADNc de β-actina suministrada con el blot (CLONTECH) para confirmar que no había la igualdad de carga de ARN en el blot (datos no mostrados). He, corazón; Br, cerebro; Pl, la placenta; Lu, pulmón; Li, hígado; Sk, esqueleto; Ki, riñón; Pa, páncreas. Un Conservadas enlazador se requiere para la interacción del ratón y RBak humana con GST-RB A pesar de la similitud de secuencia entre el ratón y RBak humano, el gran tamaño de la familia de genes KRAB nos llevó a utilizar un ensayo de interacción in vitro que confirmar que RBak humano interactuó con RB. El RBak cDNA humano fue transcrito y traducido in vitro y se aplica a GST o GST-RBp56. La masa del producto traducido fue ~ 80 kDa (masa predicha, 78,5 kDa) que era consistente con la traducción desde el primer ATG (en el pb 519) en el ADNc (Fig. 3 A). RBak humana que fue traducida in vitro interactúa físicamente con GST-RB, pero no con GST sola (Fig. 3 A), un hallazgo que es consistente con su posible homología funcional para ratón RBak con respecto a la unión de RB. Formas de humanos y de ratón RBak traducidos in vitro requieren un motivo Enlazador intacta para interactuar con GST-RB. A, autorradiografía que muestra que [35 S] metionina marcada con RBak humana transcrita y traducida in vitro interactúa con GST-RB (RB) pero no con GST sola (G). B, autorradiografía de [35 S] metionina formas marcadas de RBak ratón y RBak humano que se transcribe y traduce in vitro. se incubaron con GST (G) o GST-RB (RB) perlas de Sepharose, y se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. De entrada representa una décima parte del volumen de lisado de reticulocitos se incubaron con la proteína GST. C, diagrama esquemático que muestra formas mutadas de RBak utiliza en A y B. Debido a que no hay motivos RB-que interactúan las proteínas conocidas en RBak, el próximo tratado de determinar qué se requieren motivos de ratón y humano RBak para la unión de RB. Con el fin de determinar que define la región de RBak (el motivo KRAB, dedos de zinc, o región de unión) que se requería para la unión a RB, se realizó una serie de experimentos de unión in vitro utilizando diferentes formas de RBak. Diferentes longitudes del ratón y RBak humana fueron transcritos y traducidos in vitro para generar proteínas que contienen el KRAB y el enlazador (KL), el KRAB, y la primera mitad del enlazador (KΔL), o la región de engarce y varios dedos de zinc (LZ ) (Fig. 3 B, carriles 1-4 y 13). Estas proteínas traducidas continuación, se sometieron a ensayo para su capacidad relativa para unirse a GST o GST-RB in vitro. Como humano de longitud completa RBak (Fig 3 A.), Tanto de ratón como humano RBak-KL obligado así a GST-RB, pero no a GST sola (Fig 3 B, carriles 5, 6, 9 y 10..); por lo tanto, no se exigió a los dedos de zinc para la unión a GST-RB en este ensayo. Sin embargo, cuando se retiró la mitad carboxilo-terminal de la región de unión, la unión de ambos ratón y humanos RBak-KΔL a GST-RB fue reducido en gran medida (figura 3 B. Comparar los carriles 8 y 12 con carriles 6 y 10), un hallazgo que indica que se requiere un motivo enlazador intacta tanto para ratón y humano RBak-KL unión a GST-RB. Por último, la traducción in vitro del enlazador y varios dedos de zinc de RBak humana (hRBaK-LZ) produjo un péptido que une GST-RB con una afinidad aproxima a la de las formas de retención RBak el dominio KRAB (Fig. 3 B, carriles 13-15 , algunos datos no mostrados). En conjunto, estos resultados indican que se requieren ni el motivo KRAB ni los dedos de zinc para la unión en este ensayo GST-RB, mientras que un motivo enlazador intacta puede ser necesaria (Fig.3 C). RBak humana es una proteína nuclear de aproximadamente 80 kDa DISCUSIÓN Notas al pie Referencias
